Antes de hablar de una obra tan importante como la Capilla Sixtina es necesario hacer una pequeña alusión al pontífice que la quiso edificar. 

Sixto V fue el Papa que supo devolver a la ciudad depauperada el vigor necesario después del "saqueo" de Roma en 1527 y su primera preocupación fue la de restituir a la ciudad eterna la posibilidad de extenderse, de modo que decidió sanar las zonas malsanas y crear infraestructuras útiles al aprovechamiento de áreas ya ocupadas por los nuevos asentamientos. A su arquitecto de confianza, Domingo Fontana, el pontífice mandó construir la capilla del Santísimo Sacramento digna también de custodiar el belén.

El programa iconográfico de la decoración pictórica, que representa antepasados de Cristo, historias de la Virgen y de la vida de Jesús, tiene su centro de la Capilla del belén, situada debajo del altar que sigue conservando el antiguo Oratorio del belén, realizado por Arnolfo de Cambio en el siglo XIII, que Domenico Fontana trasladó entero desde el ábside de la Basílica. Las pinturas de la Capilla Sixtina celebran el triunfo conseguido por la Virgen, cuya maternidad divina negaba la herejía protestante, en el Concilio de Trento. La obra fue dirigida por Cesare Guerra y Giovanni Nebbia, que entre los años 1587 y 1589 recibieron el pago debido. Su mayor preocupación fue que las figuras de la Capilla Sixtina fueran la continuación natural del mensaje ya expresado en los mosaicos del arco del ábside.

Estilísticamente las pinturas "sixtinas" ceden el paso a un lenguaje muy llamativo para el observador. Eliminado todo tipo de intelectualismo o excesiva personalización artística, las imágenes proceden claras y reconocibles sin necesidad de ulteriores comentarios.

Sixto V quiso colocar en la Capilla su propia tumba y la de San Pío V, el Papa que lo consagró Cardenal. El monumento funerario del Papa es el más antiguo: fue diseñado por Fontana, mientras que la estatua es obra de Leonardo Sarzana; Sixto V fue personalmente al taller del artista, y en el junio del año 1587 quiso presenciar su erección. Juan Antonio Paracca, sobrenombrado Valsoldo, ha realizado la estatua de Sixto V: el pontífice está de rodillas y mirando bondadosamente hacia el Tabernáculo y el belén de la Cripta. El altar, obra de Sebastiano Torregiani, es bellísimo; situado en el centro de la capilla con cuatro ángeles  de bronce, de color dorado y de grandeza natural, los cuales sostienen el ciborio que representa el modelo de la misma Capilla, ricamente decorado con ángeles y profetas de forma redonda y bajorrelieves en las  ventanillas. A los pies del altar, al finalizar la doble escalera de la Confesión que lleva el Oratorio del belén, se encuentra la Natividad de Cecchino de Pietrasanta del siglo XVI, colocada sobre un altar de estilo cosmatesco.